A molekuláris biológiában a jó pufferválasztás és a különböző DNS-izolálási lépések előkészítése a különbség a fehérje expresszióra való áttérés vagy egy másik maxi-prep készlet megnyitása között. Fontosságuk ellenére a puffer receptek gyakran csak azok a receptek, amelyeket a különböző összetevők magyarázata vagy indoklása nélkül írtak. Az egyik ilyen puffer a glükóz-trisz-EDTA vagy a GTE puffer.
$config[code] not foundMit használ a GTE?
A GTE-t használják a baktériumsejt-pelletek újraszuszpendálására, mielőtt a sejteket lizáljuk, és a plazmid DNS-t betakarítjuk. A sejtmembránokat lágyító lizozimot gyakran a GTE pufferrel együtt adják hozzá. A teljes sejtek homogén szuszpenziójának elérése ebben a lépésben, hogy a későbbi hozzáadott lízisoldat minden sejtre juthasson, kulcsfontosságú a jó DNS-hozam eléréséhez. A GTE-t úgy tervezték meg, hogy ezáltal egy stabil környezetet biztosítson a DNS számára.
Glükóz Osmolaritáshoz
50mM (millimoláris) glükózcukor hozzáadódik a GTE pufferhez az ozmolaritás fenntartásához, ahol a sejteken kívüli oldott koncentráció közel van a sejtek belsejében. Ez megakadályozza a korai sejt lízist, ami alacsonyabb DNS-hozamot okozhat az aggregáció és a degradáció következtében. A puffer egyéb komponensei szintén hozzájárulnak az oldat ozmolaritásához, de a glükóz, amely nem elektrolit, jó választás, mert nem zavarja az oldat puffer tulajdonságait.
A pH stabilitása
A Tris a trisz (hidroxi-metil) -amino-metán rövid neve, ami nagyon gyakori pH-puffer. GTE puffer esetén a sav sót (Tris-HCl) 25 mM koncentrációban adjuk a pufferhez. Ez megtartja az oldat pH-ját közel fiziológiás 8,0-nál, ideális pH-ként a plazmid DNS savas hidrolízisének megakadályozására és a más sejtkomponensek nem kívánt mellékreakcióinak megakadályozására.
Az EDTA megakadályozza a DNS lebomlását
Az EDTA, vagy az etilén-diamin-tetraecetsav rögzíti vagy "kelátolja" a fémionokat az oldatból, megakadályozva, hogy részt vegyenek a nemkívánatos mellékreakciókban. GTE pufferben EDTA-t adunk 10 mM-nál. Elsődleges célja a szabad cinket, magnéziumot és kalciumot feloldó pufferben, ezáltal megakadályozva a DNS-lebontást bizonyos ilyen fémeket igénylő útvonalakon.
Néhány fontos tipp
Tartsa hideg GTE-puffert, és tegye kis mennyiségben, hogy megakadályozza a nem kívánt baktériumok növekedését. A cukor és a szabályozott pH nagy növekedési táptalajt biztosít. Mindig tisztított vizet használjon. A csapvíz túl sok fémiont tartalmazhat a csövekből, ami megdöntheti az EDTA képességét. Ha gyanítja, hogy interferáló RNS jelen van a mintában, adjon hozzá 100 mikrogramm / ml RNáz A-t a GTE-pufferhez a probléma kiküszöböléséhez.
